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NameMethodenbeschreibung NGS
GruppeMolekulargenetik
Material 
Beschreibung Das Next Generation Sequencing (NGS) ist eine Methode der Hochdurchsatz-Sequenzierung, die die parallele Sequenzierung von vielen Genen in vielen verschiedenen Patientenproben in einem Workflow ermöglicht. Diese parallele Hochdurchsatz-Sequenzierung bietet einen großen Vorteil hinsichtlich der Bearbeitungszeit gegenüber der herkömmlichen Sanger-Sequenzierung und ermöglicht die Reduzierung der Analysekosten. Detektierbar sind Sequenzvarianten im Vergleich zu einer Referenz-Sequenz.4

Unser Labor verfügt über das Ion GeneStudio S5 System der Ion Torrent Plattform, mit dem Sequenzer Ion S5 XL der Firma ThermoFisher Scientific.

Die Amplifizierung der Target-Regionen erfolgt mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR). Die Ion Torrent Technologie ist eine post-light-Sequenziertechnologie, die die Reihenfolge der Nukleotide in der Sequenz über gemessene pH-Wert-Veränderungen detektiert. Alle Sequenzdaten werden bioinformatisch ausgewertet.

Auswertungskriterien: Die Analyse der Daten erfolgt mit dem Modul SeqNext der Software SeqPilot (Version 5.0.0 build 508). Berücksichtigt werden Rohdaten mit einer Sequenztiefe (Coverage) von mindestens 30fach und Varianten mit einer Allel-Read-Frequenz von >20%.
Genetische Varianten werden analog zu Sharon E. Plon et al. (2008) Hum Mutat 29:1282ff in fünf Klassen eingeteilt: Klasse 1 (benigne), Klasse 2 (wahrscheinlich benigne), Klasse 3 (Variante unklarer Signifikanz) , Klasse 4 ( wahrscheinlich pathogen), Klasse 5 (pathogen). Veränderungen, die gemäß dieser Einteilung den Klassen 1 und 2 zuzuordnen sind, werden bei der bioinformatischen Analyse weggefiltert und im Befund nicht ausgewiesen. Auf Anfrage können diese übermittelt werden.
Bei Bedarf werden in-silico-Analysen z.B. mit den Programmen Mutation Taster, PolyPhen2 und/oder Mutation Assessor durchgeführt. Folgende Datenbanken werden genutzt: HGMD professional (The Human Gene Mutation Database (https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/gene.ph p?), LOVD -IARC (Leiden Open Variation Database, http://grenada.lumc.nl/LSDB_list/lsdbs), dbSNP, ClinVar sowie ggf. spezielle locus.-spezifische Datenbanken.

Varianten in nicht analysierten Bereichen der untersuchten Gene (z.B. untranslatierte Regionen, regulative Genbereiche), in Regionen mit multiplen Kopien hoher Sequenzhomologie, Repeat-Varianten sowie Kopienzahl-Veränderungen einzelner Exons oder eines kompletten Gens können nicht erfasst und somit nicht ausgeschlossen werden. Außerdem können Mosaike mit geringem Frequenzanteil nicht sicher ausgeschlossen werden. Obwohl unwahrscheinlich, ist es außerdem möglich, dass sich aufgrund neuer wissenschaftlicher Erkenntnisse die Einschätzung der Pathogenität von Varianten zu einem späteren Zeitpunkt verändern könnte.

Die Sensitivität zur Detektion von klinisch relevanten Varianten für die angewendeten Verfahren beträgt >96%.

Weitere Informationen sind auf Anfrage erhältlich.